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簡(jiǎn)要描述：通用PCR試劑盒適用于各種 RNA制品的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以及隨后的PCR擴(kuò)增。通用PCR試劑盒它采用M-MLV進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，能夠獲得較長(zhǎng)的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。同時(shí)，在20ul反轉(zhuǎn)錄體系和50ul PCR反應(yīng)體系中，還可以一次性得到足夠量的PCR產(chǎn)物用于后續(xù)的克隆實(shí)驗(yàn)。
產(chǎn)品型號(hào)：
所屬分類：PCR試劑盒
更新時(shí)間：2020-12-17
通用PCR試劑盒
本試劑盒適用于各種 RNA制品的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以及隨后的PCR擴(kuò)增。它采用M-MLV進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，能夠獲得較長(zhǎng)的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。同時(shí)，在20ul反轉(zhuǎn)錄體系和50ul PCR反應(yīng)體系中，還可以一次性得到足夠量的PCR產(chǎn)物用于后續(xù)的克隆實(shí)驗(yàn)。本試劑盒中配制的酶均為進(jìn)口的酶。RT酶采用進(jìn)口的M-MLV，所以cDNA更長(zhǎng)，基因的信息保留得更完整！反轉(zhuǎn)錄過程中特異的RNase抑制劑可有效降低由于外源RNase污染而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗的風(fēng)險(xiǎn)。本試劑盒使用方便、快捷，可廣泛用于cDNA克隆及目的基因檢測(cè)等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
通用RT-PCR試劑盒(M-MLV)產(chǎn)品簡(jiǎn)介
莫洛尼鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV RT）是一種RNA依賴的DNA聚合酶，能使mRNA（>5kb）轉(zhuǎn)錄為cDNA。M-MLV RT的RNase H活性相對(duì)于禽成髓細(xì)胞瘤病毒反轉(zhuǎn)錄酶較弱，更適合用來反轉(zhuǎn)錄較長(zhǎng)的mRNA。M-MLV RT應(yīng)用于以RNA為模板合成cDNA的一條鏈。
注意：M-MLV RT的延伸性要低于AMV 反轉(zhuǎn)錄酶，因此要得到和用AMV 反轉(zhuǎn)錄酶一樣產(chǎn)量的cDNA需加入更多單位的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶。
通用RT-PCR試劑盒使用方法
1）使用方法簡(jiǎn)介以用2mg總RNA為例。在無RNase離心管中，加入0.5mg引物至含總RNA的樣品中，總體積不大于15ml。70℃，5分鐘打開模板鏈形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)。立即放于冰上降溫防止二級(jí)結(jié)構(gòu)恢復(fù)，隨后短暫離心使液體集中在離心管底。
2）加入以下成分到已退火后的引物-模板混合物中。
注意：不要改變引物的加入比率。
通用PCR試劑盒常見問題與解決方法:
| 常見問題 | 可能原因 | 解決方法 |
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陽性對(duì)照、待測(cè)樣本均無條帶。 | PCR反應(yīng)體系或反應(yīng)條件不合適。 | 使用梯度PCR摸索PCR反應(yīng)條件。 |
| PCR試劑保存不當(dāng)失去活性。 | 2× PCR Mix應(yīng)保存于-20℃，使用時(shí)避免反復(fù)凍融。若使用頻繁，可在4℃短時(shí)間存放。 | |
| 引物設(shè)計(jì)問題。 | 嘗試重新設(shè)計(jì)引物進(jìn)行檢查。 | |
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陽性對(duì)照有目的條帶，待測(cè)樣本無條帶或條帶弱。 | 不當(dāng)儲(chǔ)存或長(zhǎng)期儲(chǔ)存引起試劑活性喪失。 | 使用新鮮的試劑。 |
| 加入組織裂解液過量。 | 增大反應(yīng)體系，或減少裂解液的用量。 | |
| 樣本裂解混合液保存不當(dāng)或保存時(shí)間過久，DNA基因組已經(jīng)降解。 | 裂解混合液液可在4℃保存2-3天，盡量使用新制備的裂解液混合液進(jìn)行PCR。 | |
| 模板加入量不適合。 | 在反應(yīng)體系10-20%范圍內(nèi)優(yōu)化模板加入量。反應(yīng)效性能較差時(shí)，可以降模板濃度調(diào)節(jié)到低于10%的范圍。 | |
| PCR循環(huán)數(shù)不足。 | 適當(dāng)增加PCR的循環(huán)數(shù)，推薦在35-40循環(huán)為佳。因?yàn)槟０鍙?fù)雜，一般PCR反應(yīng)要比用純化的 DNA模板多5-10個(gè)循環(huán)為佳。 | |
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非特異性擴(kuò)增 | PCR退火溫度太低，循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度太高。 | 增加PCR退火溫度，降低PCR循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度。 |
| PCR引物錯(cuò)配。 | 重新設(shè)計(jì)PCR引物。 | |
| 配制PCR反應(yīng)體系時(shí)溫度太高或配制完成后放置時(shí)間太久。 | PCR反應(yīng)體系的配制在低溫下進(jìn)行，配制完成后盡快進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。 | |
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陰性對(duì)照出現(xiàn)目的條帶 | 操作工具或試劑污染。 | 實(shí)驗(yàn)所有試劑或器材均應(yīng)高壓滅菌。操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。 |
| 樣本間交叉污染。 | 每個(gè)取樣器只對(duì)一個(gè)樣本使用；或取完一個(gè)樣本后，將取樣器刃口浸入2%的次氯酸鈉溶液中，反復(fù)涮洗，然后用干凈的紙巾擦干殘液。 |
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