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簡要描述：探針法熒光定量PCR試劑盒是使用探針法進行qPCR實驗的 即用型優(yōu)化預混液。兼容所有的qPCR檢測儀器,多種模板。探針法熒光定量PCR試劑盒使用時僅需加入模板、探針和引物即可進行實驗。
產(chǎn)品型號：
所屬分類：PCR試劑盒
更新時間：2024-01-26
探針法熒光定量PCR試劑盒它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品RNA模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。
3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據(jù)小反芻獸疫病毒高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他病毒的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應(yīng)。
6. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
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成分 |
編號 |
十孔盒包裝 |
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探針法 qRT-PCR 緩沖液 |
A |
500μL（黃蓋） |
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探針法 qRT-PCR 酶混合液 |
B |
100μL（紅蓋） |
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熒光 PCR 模板稀釋液 |
C |
1 mL（黃蓋） |
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探針法 qRT-PCR引物混合液 |
D |
100 μL（白蓋） |
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小反芻獸疫病毒 qRT-PCR 探針 |
E |
50 μL（棕色管） |
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探針法 qRT-PCR陽性對照(1×10E8 拷貝/μL) |
F |
50 μL（黃蓋） |
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核酸釋釋劑（試用裝） |
G |
20 次（1mL，綠蓋） |
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使用手冊 |
H |
一份 |
運輸及保存： 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為12個月。
探針法熒光定量PCR試劑盒自備試劑 ：樣品 RNA。
使用方法
一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照。
1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 RNA 的制備
7. 如果有N個樣品，設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL陽性對照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。
8. 用自選方法純化樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容。也以選購本公司的柱式病毒RNAout。本試劑盒免費贈送20次免RNA提取的核酸釋放劑試用裝，該釋放劑的裂解液可以直接作為RT-PCR模板，省略了RNA提取步驟。
三、Probe qRT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進行）
9. 如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個PCR 管，其中N+2個用于上步得到的 N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復，則標記N+4 個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（用第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加）：
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成分 |
樣品管N+2個 |
RT-PCR陰性對照管 |
標準曲線樣品管
（2-7 管） |
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探針法qPCR緩沖液 |
各 10 μL |
10 μL |
各 10 μL |
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探針法 qPCR 酶混合液 |
各 2 μL |
2 μL |
各 2 μL |
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qRT-PCR探針 |
各 1 μL |
1 μL |
各 1 μL |
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探針qRT-PCR
引物混合液 |
各 2 μL |
2 μL |
各 2 μL |
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待測樣品 RNA 模板 |
各 5 μL |
-- |
-- |
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超純水 |
-- |
5 μL |
-- |
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第 7 步所得標準曲線樣品稀釋液（2-7 號） |
-- |
-- |
各5 μL（2號樣到2號管，3號樣到3 號管…） |
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過程 |
溫度 |
時間 |
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逆轉(zhuǎn)錄 |
50℃ |
30 min |
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預變性 |
94℃ |
10 min |
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qRT-PCR 反應(yīng)（40 個循環(huán)） |
94℃ |
15 sec |
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60℃ |
1 min（采集 FAM 通道的熒光信號） |
五、數(shù)據(jù)處理
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 35，則為陽性。
六、常見問題與解決方法:
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常見問題 |
可能原因 |
解決方法 |
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陽性對照、待測樣本均無條帶。 |
PCR反應(yīng)體系或反應(yīng)條件不合適。 |
使用梯度PCR摸索PCR反應(yīng)條件。 |
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PCR試劑保存不當失去活性。 |
2× PCR Mix應(yīng)保存于-20℃，使用時避免反復凍融。若使用頻繁，可在4℃短時間存放。 | |
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引物設(shè)計問題。 |
嘗試重新設(shè)計引物進行檢查。 | |
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陽性對照有目的條帶，待測樣本無條帶或條帶弱。 |
不當儲存或長期儲存引起試劑活性喪失。 |
使用新鮮的試劑。 |
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加入組織裂解液過量。 |
增大反應(yīng)體系，或減少裂解液的用量。 | |
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樣本裂解混合液保存不當或保存時間過久，DNA基因組已經(jīng)降解。 |
裂解混合液液可在4℃保存2-3天，盡量使用新制備的裂解液混合液進行PCR。 | |
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模板加入量不適合。 |
在反應(yīng)體系10-20%范圍內(nèi)優(yōu)化模板加入量。反應(yīng)效性能較差時，可以降模板濃度調(diào)節(jié)到低于10%的范圍。 | |
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PCR循環(huán)數(shù)不足。 |
適當增加PCR的循環(huán)數(shù)，推薦在35-40循環(huán)為佳。因為模板復雜，一般PCR反應(yīng)要比用純化的 DNA模板多5-10個循環(huán)為佳。 | |
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非特異性擴增 |
PCR退火溫度太低，循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度太高。 |
增加PCR退火溫度，降低PCR循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度。 |
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PCR引物錯配。 |
重新設(shè)計PCR引物。 | |
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配制PCR反應(yīng)體系時溫度太高或配制完成后放置時間太久。 |
PCR反應(yīng)體系的配制在低溫下進行，配制完成后盡快進行PCR擴增反應(yīng)。 | |
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陰性對照出現(xiàn)目的條帶 |
操作工具或試劑污染。 |
實驗所有試劑或器材均應(yīng)高壓滅菌。操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。 |
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樣本間交叉污染。 |
每個取樣器只對一個樣本使用；或取完一個樣本后，將取樣器刃口浸入2%的次氯酸鈉溶液中，反復涮洗，然后用干凈的紙巾擦干殘液。 |
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