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細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)孔的孔數(shù)有6、12、24、48、96、384、1536 孔等,孔的底部可以選擇平的、圓的,或錐形的,這取決于細(xì)胞類型和下游應(yīng)用。對于傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)(如HeLa或MDCK細(xì)胞),特別是需要對培養(yǎng)物進(jìn)行成像或分光光度測定,通常選平底(F-bottom)。對于不存在接觸抑制的細(xì)胞,弧形底(C-bottom)也不錯。圓底(U-bottom)適合懸浮培養(yǎng)(如球體細(xì)胞培養(yǎng)),因?yàn)閳A的表面讓細(xì)胞難以附著和生長。而錐形底很少用于細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),但在細(xì)胞沉淀時可能有用。
以下主要為大家介紹6、24、96孔板接種和換液問題。
問題1:細(xì)胞傳代很正常,但一種到六孔板里(不管加藥和對照),總有兩三個孔(隨機(jī))細(xì)胞長得不好,很小,像破碎了。有人遇到過這種情況嗎?到底是啥原因呢?
答:可能跟加液的溫度有關(guān)。如果細(xì)胞剛剛拿出來換液加液,培養(yǎng)基也是從4度冰箱拿出來不久,很容
易細(xì)胞就會凍死了。建議最好把培養(yǎng)基先在培養(yǎng)箱里邊孵育15min先。
另外,跟細(xì)胞的生長狀態(tài)也有關(guān)。加藥之前的細(xì)胞可以用高點(diǎn)的血清濃度培養(yǎng)。保證細(xì)胞狀態(tài)良好。
或者放在37度水浴鍋里孵育也可以,或者是培養(yǎng)板本身的問題,再換換其他培養(yǎng)板試試看。再有可能就是細(xì)胞狀態(tài)問題了,種板時的血清濃度調(diào)高試一下。
問題2:用六孔培養(yǎng)板接種細(xì)胞,培養(yǎng)24小時后更換培養(yǎng)基,在更換培養(yǎng)基之前,顯微鏡觀察到細(xì)胞貼壁,狀態(tài)非常的好,更換了培養(yǎng)基后,立即用顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)每個孔中都近乎有一半的細(xì)胞表現(xiàn)出近乎死亡的狀態(tài)。細(xì)胞變得非常小,產(chǎn)生大量的碎片,而另一半的細(xì)胞一切正常,異常細(xì)胞與正常細(xì)胞之間存在一條分水嶺,上半個圓是好的,下半個圓就不好,這是怎么一回事?
答:1.可以看一下是不是培養(yǎng)板沒放水平。
2.培養(yǎng)液如何,如果培養(yǎng)液過期,細(xì)胞就不會貼壁。換一點(diǎn)新配制的培養(yǎng)液試一試。
3.可能是板的問題,換一個牌子的板或換用培養(yǎng)瓶就沒問題了。
4.所需換液的培養(yǎng)板多不多,換培養(yǎng)基的時候如果沒有注意風(fēng)機(jī)的影響,特別是所需換液的培養(yǎng)板很多時,容易使細(xì)胞因風(fēng)吹失水而干縮破裂。如果如此,換液時應(yīng)該逐個培養(yǎng)板進(jìn)行,別怕浪費(fèi)吸管,注意操作的效率!
問題1:把細(xì)胞消化接種到24孔板之后,已經(jīng)四天了,老是每孔的中間部分長不滿,每天換液時都用PBS 清洗,第二天換液時都出現(xiàn)同樣的情況,每孔的邊緣長的很好,中央大量死細(xì)胞,也不知道是什么原因?
答:是中央長不滿,還是中央有和邊緣相同密度的細(xì)胞,但是大部分都是死細(xì)胞?如果是前者,也許不是技術(shù)問題,而是物理問題了。
選擇孔內(nèi)鋪蓋玻片,在玻片上種植。每次換液都用PBS洗,是必要的步驟嗎?另外,也有可能和細(xì)胞種類有關(guān)或者和培養(yǎng)液有關(guān)?
如果培養(yǎng)液加的太少了。由于表面張力的作用,培養(yǎng)板的邊緣液體會向上走,造成培養(yǎng)液面呈現(xiàn)一個凹面(就像量筒的液體凹面一樣),中央的細(xì)胞正好在凹面的Lowest處,培養(yǎng)液少,細(xì)胞的營養(yǎng)不夠,甚至干涸掉,空氣中的氧氣也會造成損傷,即使有增值過來的細(xì)胞也會死掉。
另外,檢查一下培養(yǎng)箱底部的水是否少了,如果少了,箱內(nèi)的空氣濕度不夠,會造成培養(yǎng)液揮發(fā)加快,這樣即使剛加的液體不少,過一段時間,由于蒸發(fā),液體量會減少,造成中央干涸。并且這樣會改變了培養(yǎng)液的成分濃度,造成滲透壓過高。
個人經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為這是物理問題:24孔板小,細(xì)胞接種進(jìn)去后是很難搖均勻的,結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞重貼壁后呈現(xiàn)四周密中間稀的狀況。
至于中間較多死細(xì)胞,如果是懸浮狀的話,也一樣是物理問題。接種后比較粗暴的碰撞,似乎對搖均勻細(xì)胞有一定效果。
在為多孔板培養(yǎng)的細(xì)胞換液時一定要注意,不要把培養(yǎng)基吸得太干,如果全部吸取,很容易造成細(xì)胞干涸,這樣的話細(xì)胞會很快死亡。
同時細(xì)胞周圍密而中間稀疏,大約有如下原因
1.培養(yǎng)液加得太少。主要是由于液體張力的問題。
2.細(xì)胞接種后震蕩太厲害了。由于離心力作用導(dǎo)致細(xì)胞分布到周圍。
問題2:細(xì)胞在接種在24孔板上時,孔的周圍細(xì)胞密集,中間細(xì)胞稀少,試了很多次均如此。請問怎樣操作才能使細(xì)胞分布均勻?
答:這種情況一般是種板時培養(yǎng)液過少,液面總是呈一凹面,如果液面過低,孔中間就基本上沒什么細(xì)胞,所以種板時一定不能吝嗇培養(yǎng)液,待貼壁后可以用比較少量的培養(yǎng)液處理
周圍細(xì)胞稀少,中間細(xì)胞密集:這種情況一般是種板后過于晃動,特別是旋轉(zhuǎn)著晃動.有人才用十字方向的晃動方法使細(xì)胞分散均勻.但本公司研究人員認(rèn)為,將細(xì)胞加入孔后,用槍或移液器充分吹打混勻后就不用,也不能再晃動,甚至拿著孔板走路帶來的震動都會讓細(xì)胞往中間集中。
當(dāng)然,無論是哪種情況,首先都需要保證細(xì)胞在種板時時均勻分布的,即種板時的細(xì)胞懸液一定要混勻。
根據(jù)細(xì)胞的特性,細(xì)胞均喜歡聚集在邊緣生長,所以考慮到,還有可能是接種時的細(xì)胞密度不夠,導(dǎo)致周邊密集,中間稀疏的錯覺。
另"要慢慢加樣,且記得輕微旋轉(zhuǎn)槍頭"。加樣不能太快,避免細(xì)胞在一個加樣處聚集,且注意在不同的部位進(jìn)行加樣,即邊加邊活動槍頭,人為使細(xì)胞趨于均勻分布。
問題1:用96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞,結(jié)果細(xì)胞長得不是很理想,不是長得不均勻,就是每個孔細(xì)胞生長速度不一樣。另外,鏡下觀察細(xì)胞輪廓很不清晰,怎么調(diào)焦距效果都不好。(板子是剛拆封的。)不知道怎么回事?
答:首先要盡可能把消化細(xì)胞消化成單個細(xì)胞(不要成團(tuán)),反復(fù)吹打,掌握好時間(不同的細(xì)胞要摸索的),種細(xì)胞時要均勻的吸取,清清的吹打一遍再吸取細(xì)胞,這樣也許會解決問題。
種到96孔板的細(xì)胞一定要消化成單個細(xì)胞,建議用EDTA和Pancreatic enzymes消化。加血清后反復(fù)吹打。細(xì)胞量盡量少一點(diǎn)。
提議:
1、對細(xì)胞的選擇要注意,要選擇狀態(tài)好的細(xì)胞,密度要選分布瓶底80%為宜;
2、消化時,不要忘了用PBS(或純的不含血清的培養(yǎng)基)洗一遍,加0.25%的Pancreatic enzymes1ml消化2-3分鐘(不同的細(xì)胞有差別,要摸索),還要不時的活動,讓Pancreatic enzymes分布到每個角落,之后傾去Pancreatic enzymes,加3ml培養(yǎng)基(加血清過于粘稠,不宜吹打,加培養(yǎng)基后稀釋Pancreatic enzymes可不考慮對細(xì)胞的損傷),吹打成單個細(xì)胞;
3、接種時要注意細(xì)胞密度,多數(shù)細(xì)胞要求0.5-2的10的4次冪,這也要摸索一下(簡單:就是種一個密度,如果在測指標(biāo)時細(xì)胞沒過多影響結(jié)果就行);
4、周邊的孔不要做指標(biāo)檢測孔,有沒有發(fā)現(xiàn)周邊的孔的細(xì)胞2天后狀態(tài)就明顯不好了;
5、接種細(xì)胞調(diào)整好濃度后,要一邊吹細(xì)胞懸液一邊接種;
6、還有看不清細(xì)胞,注意到?jīng)]有,當(dāng)把培養(yǎng)板拿出孵箱一會,培養(yǎng)板蓋就有一層霧,會影響觀察細(xì)胞,是不是這個問題?
問題2:在96孔培養(yǎng)板上接種的細(xì)胞很均勻,但換液時,用槍加150ul的培養(yǎng)基加入每個孔內(nèi),結(jié)果在顯微鏡下觀察周邊細(xì)胞全被沖到孔中央去了,而中間的細(xì)胞層疊成致密的團(tuán)塊,請問這樣的細(xì)胞對實(shí)驗(yàn)有影響嗎?有其他的好辦法嗎? 是3T3-L1前脂肪細(xì)胞,要進(jìn)行誘導(dǎo)分化成成熟脂肪細(xì)胞。所以每次換液總把握不好。請問有誰有這方面的經(jīng)驗(yàn)嗎?
答:我們實(shí)驗(yàn)室一般用機(jī)械吸引器吸引,吸引器管前面套一個20ul加樣器的Tip頭,效果不錯,操作在無菌臺內(nèi)進(jìn)行。Tip頭剪去Tip后滅菌使用,加液時液體呈滴狀滴入,就不會擾動孔底的細(xì)胞了。
建議:加液的時候沿著邊輕輕的加入,動作柔和,可以避免沖動細(xì)胞;去液的時候直接甩板,方便快捷。
去液的時候不建議直接甩板,容易污染??梢约舻魌ip尖,不能直接沖細(xì)胞,沿孔壁輕輕加入,液體提前在孵箱里預(yù)熱10分鐘,有時候液體涼也會使細(xì)胞掉下來。
在96孔板中誘導(dǎo)細(xì)胞換液一般采用半量換液,這樣細(xì)胞就不會被沖走了,至于換液的間隔與細(xì)胞有關(guān),如果卷得特別厲害,很可能是細(xì)胞的問題,建議更新細(xì)胞株。
問題3:細(xì)胞對Pancreatic enzymes和EDTA不管用.高濃度Pancreatic enzymes可以,但細(xì)胞存活率不高,有沒有小的細(xì)胞刮匙,(或者自制刮匙的方法),可以用于96孔板?(在建細(xì)胞系,非得用96孔板)。
答:一般情況下細(xì)胞在一次性培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中貼壁較緊,都不太好消化,如果建系的話最好不用刮的方法,還是消化比較好!消化時以下幾點(diǎn)注意了嗎?
消化前用D-Hanks沖洗了嗎?可以沖洗2-3遍。
適當(dāng)增加Pancreatic enzymes濃度,提高Pancreatic enzymesPH值到8,減少消化時間應(yīng)該對細(xì)胞影響不大。消化時放入37度培養(yǎng)箱。
如果細(xì)胞還是消化不下來可加適量膠原酶,有的細(xì)胞對膠原酶敏感。
問題4:D-Hanks和PBS沖洗效果有何不同?在Pancreatic enzymes消化前一直用PBS沖洗。
答:首先,D-Hanks和PBS沖洗細(xì)胞都可以的,不過嚴(yán)格來說D-Hanks更好,因?yàn)镻ancreatic enzymes是用D-Hanks溶的,所以用D-Hanks不改變Pancreatic enzymes的消化環(huán)境。
第二個問題,可以不用wash,加入帶血清的培養(yǎng)基之后Pancreatic enzymes將沒有作用,但是如果EDTA濃度太高的話就需要wash了。